Productes

Per quantificar específicament diversos metabòlits de 5-fluorouracil (5-FU) i dos nucleòtids de monofosfat endògens, vam desenvolupar un mètode original basat en una cromatografia líquida-espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS).Aquest assaig va permetre determinar: (i) la producció intracel·lular de 5-fluoro-2′-desoxiuridina-5′-monofosfat (5-FdUMP) a partir de 5-FU o 5-fluoro-2′-desoxiuridina (5-FdUrd) , (ii) l'impacte de la concentració de 5-FdUMP en la relació intracel·lular 2′-desoxiuridina-5′-monofosfat (dUMP)/timidina-5′-monofosfat (TMP) i (iii) l'extensió de secreció de 5-FdUMP i 5-FU de cèl·lules cultivades humanes mitjançant transportadors ABC.En les nostres condicions experimentals, les cèl·lules es van incubar amb 5-FU o 5-FUrd.Aleshores, les proteïnes cel·lulars van ser precipitades pel metanol.Aquest procediment va proporcionar una alta recuperació d'extracció.A més, per mesurar la secreció de 5-FU i 5-FdUMP de les cèl·lules, hem dut a terme la quantificació d'aquestes molècules en medi de cultiu.Els mitjans es van injectar directament (5-FU) o es van extraure en fase sòlida mitjançant un cartutx d'extracció de cera Oasis (5-FdUMP).La separació dels analits es va realitzar en una columna dC18 Atlantis 3, 5 μm, (100 mm × 2, 1 mm id) amb mode isocràtic mitjançant tampó de formiat d'amoni/metanol/aigua (5/5/90, v/v) com a fase mòbil.El temps d'execució no va superar els 6,2 minuts.Els analits es van ionitzar en una interfície electrospray en mode d'ions negatius.Vam validar el mètode en un rang de 2,5-150 ng mL -1 segons els compostos.La variabilitat intra i interassaig va ser inferior al 10% durant set dies.Tots els compostos eren estables a les cèl·lules o al medi de cultiu quan les mostres es van emmagatzemar a -20 ° C durant almenys dues setmanes i després de tres cicles de congelació-descongelació.No es va observar cap efecte de matriu en ambdós mitjans.