IPTG (isopropil-β-D-tiogalactoside) és un anàleg del substrat de la β-galactosidasa, que és altament inductible.Sota la inducció d'IPTG, l'inductor pot formar un complex amb la proteïna represora, de manera que es canvia la conformació de la proteïna represora, de manera que no es pot combinar amb el gen objectiu i el gen objectiu s'expressa de manera eficient.Llavors, com s'ha de determinar la concentració d'IPTG durant l'experiment?Com més gran millor?
En primer lloc, entenem el principi de la inducció d'IPTG: l'operó (element) de lactosa d'E. coli conté tres gens estructurals, Z, Y i A, que codifiquen β-galactosidasa, permeasa i acetiltransferasa, respectivament.lacZ hidrolitza la lactosa en glucosa i galactosa, o en al·lactosa;lacY permet que la lactosa del medi passi a través de la membrana cel·lular i entri a la cèl·lula;lacA transfereix el grup acetil de l'acetil-CoA al β-galactòsid, que implica l'eliminació de l'efecte tòxic.A més, hi ha una seqüència operativa O, una seqüència inicial P i un gen regulador I. El codi del gen I és una proteïna repressora que es pot unir a la posició O de la seqüència de l'operador, de manera que l'operó (meta) queda reprimit i Apagat.També hi ha un lloc d'unió per al lloc d'unió proteïna-CAP activador del gen catabòlic aigües amunt de la seqüència inicial P. La seqüència P, la seqüència O i el lloc d'unió CAP constitueixen junts la regió reguladora de l'operó lac.Els gens codificants dels tres enzims estan regulats per la mateixa regió reguladora per aconseguir l'expressió coordinada dels productes gènics.
En absència de lactosa, l'operó lac (meta) es troba en estat de repressió.En aquest moment, el repressor lac expressat per la seqüència I sota el control de la seqüència del promotor PI s'uneix a la seqüència O, la qual cosa impedeix que l'ARN polimerasa s'uneixi a la seqüència P i inhibeix l'inici de la transcripció;quan hi ha lactosa, es pot induir l'operó lac (meta) En aquest sistema d'operó (meta), l'inductor real no és la lactosa mateixa.La lactosa entra a la cèl·lula i és catalitzada per la β-galactosidasa per convertir-la en al·lactosa.Aquesta última, com a molècula inductora, s'uneix a la proteïna repressora i modifica la conformació de la proteïna, la qual cosa comporta la dissociació de la proteïna repressora de la seqüència O i la transcripció.L'isopropiltiogalactoside (IPTG) té el mateix efecte que l'al·lolactosa.És un inductor molt potent, que no és metabolitzat pels bacteris i és molt estable, per la qual cosa és molt utilitzat en laboratoris.
Com determinar la concentració òptima d'IPTG?Prengui E. coli com a exemple.
La soca d'E. coli BL21 modificada genèticament que contenia el pGEX recombinant positiu (CGRP/msCT) es va inocular en un medi líquid LB que contenia 50 μg·mL-1 Amp i es va cultivar durant la nit a 37 °C.El cultiu anterior es va inocular en 10 ampolles de medi líquid LB fresc de 50 ml que contenien 50 μg · mL-1 Amp en una proporció d'1:100 per al cultiu d'expansió, i quan el valor OD600 era de 0,6 ~ 0,8, es va afegir IPTG a la concentració final.És 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Després de la inducció a la mateixa temperatura i al mateix temps, se'n va extreure 1 mL de la solució bacteriana, i les cèl·lules bacterianes es van recollir per centrifugació i es van sotmetre a SDS-PAGE per analitzar la influència de diferents concentracions d'IPTG en l'expressió de proteïnes, i després seleccionar la concentració d'IPTG amb la major expressió de proteïna.
Després dels experiments, es comprovarà que la concentració d'IPTG no és tan gran com sigui possible.Això es deu al fet que l'IPTG té una certa toxicitat per als bacteris.Superar la concentració també matarà la cèl·lula;i en termes generals, esperem que com més proteïna soluble s'expressi a la cèl·lula, millor, però en molts casos quan la concentració d'IPTG és massa alta, es formarà una gran quantitat d'inclusió.cos, però la quantitat de proteïna soluble va disminuir.Per tant, la concentració d'IPTG més adequada sovint no és com més gran millor, sinó com més baixa sigui la concentració.
El propòsit de la inducció i el cultiu de soques modificades genèticament és augmentar el rendiment de la proteïna objectiu i reduir els costos.L'expressió del gen objectiu no només es veu afectada pels propis factors de la soca i el plasmidi d'expressió, sinó també per altres condicions externes, com ara la concentració de l'inductor, la temperatura d'inducció i el temps d'inducció.Per tant, en general, abans d'expressar i purificar una proteïna desconeguda, el millor és estudiar el temps d'inducció, la temperatura i la concentració d'IPTG per tal de seleccionar les condicions adequades i obtenir els millors resultats experimentals.
Hora de publicació: 31-12-2021