Productes

Nou assaig de cromatografia líquida d'alt rendiment per a glicosiltransferases basat en derivatització amb àcid antranílic i detecció de fluorescència.

Els assajos es van desenvolupar utilitzant la química d'etiquetatge única de l'àcid 2-aminobenzoic (2AA; àcid antranílic, AA) per mesurar les activitats tant de la β1-4 galactosiltransferasa (GalT-1) com de l'α2-6 sialiltransferasa (ST-6) mitjançant un líquid d'alt rendiment. cromatografia (HPLC) amb detecció de fluorescència (Anumula KR. 2006. Avenços en mètodes de derivatització de fluorescència per a l'anàlisi cromatogràfica líquida d'alt rendiment d'hidrats de carboni de glicoproteïnes. Anal Biochem. 350:1-23).La N-acetilglucosamina (GlcNAc) i la N-acetil-lactosamina es van utilitzar com a acceptors i el difosfat d'uridina (UDP) -galactosa i l'àcid N-acetilneuramínic (NANA) de citidina monofosfat (CMP) com a donants de GalT-1 i ST-6, respectivament.Els productes enzimàtics es van etiquetar in situ amb AA i es van separar dels substrats a la columna TSKgel Amide 80 utilitzant condicions de fase normal.Les unitats enzimàtiques es van determinar a partir de les àrees màximes en comparació amb els estàndards derivats de forma concomitant Gal-β1-4GlcNAc i NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Es va establir la linealitat (temps i concentració enzimàtica), la precisió (intraassaig i interassaig) i la reproductibilitat dels assajos.Es va trobar que els assajos eren útils per controlar les activitats enzimàtiques durant l'aïllament i la purificació.Els assajos van ser altament sensibles i van tenir un rendiment igual o millor que les mesures tradicionals basades en sucre radioactiu.El format d'assaig també es pot utilitzar per mesurar l'activitat d'altres transferases, sempre que els acceptors de carbohidrats continguin un extrem reductor per a l'etiquetatge.Es va desenvolupar un assaig per als acceptors de glicoproteïnes mitjançant IgG.Es va desenvolupar un mètode de perfilat HPLC curt per a la separació de glicans IgG (biantennaris G0, G1, G2, mono- i disialilats), que va facilitar la determinació de les activitats GalT-1 i ST-6 de manera ràpida.A més, aquest mètode de perfil hauria de ser útil per controlar els canvis en els glicans IgG en entorns clínics.